青黴菌屬過敏原蛋白質Pen c 20的鑑定、選殖及重組蛋白的表現
( Identification, Cloning and Expression of the allergen Pen c 20 from Penicillium citrinum )

賴威妤

壹.導論

一.過敏疾病及致病機轉

近年來社會進步,文明發達、預防醫學更是突發猛進,許多流行性傳染病逐漸被控制,甚至於消聲匿跡,但由於環境污染造成居住品質的惡化,再加上飲食習慣改變,使得過敏疾病不但沒有減少,反而有增加的趨勢,平均發生率約為10%~20%間,過敏疾病已成為現代社會中主要的文明病之一。

過敏(Allergy)的觀念最早是由Pirquet在1906年提出的,它的發生是由於敏感性個体第一次受到一些外界中無害的物質刺激,在体內產生免疫反應,當其再次暴露於相同物質的環境時,便會產生過敏反應。過敏反應根據Gell-Coombs的分類系統可分為四型:

第一型過敏反應的發生是由於過敏原(allergen)與血清中的IgE抗体反應,活化了肥大細胞(mast cells)進而引起一些已合成的過敏介質(mediators)如組織胺(histamine)的釋放,因而產生過敏症狀。

第二、三型過敏反應則是過敏原與血清中的IgG抗体反應,引起吞噬細胞(phagocytes)或是補体(complements)所調控的免疫反應。若過敏原是連結於細胞上則屬於第二型過敏反應,此種過敏反應會造成組織的損傷。引起第三型過敏反應的過敏原則是水溶性的抗原(soluble antigen),此種過敏反應會造成局部的發炎。此三種過敏反應皆屬於立即型的過敏反應(immediate hypersensitivity reactions)。

第四型過敏反應又稱為延遲型過敏反應(delayed-type hypersensitivity reactions),非由抗体所引發,而是由T細胞所調控,往往需要二十四至七十二小時的時間才能看到症狀。

一般而言,第一型過敏反應是最普遍發生的過敏反應。

 過敏疾病為一多因子致病機轉,其間包括了外在的環境因素及內在的遺傳因素等。一般常見的過敏性疾病有氣喘(asthma)、過敏性鼻炎(allergic rhinitis)、異位性皮膚炎(atopic dermatitis)、濕疹(eczama)等。其中過敏性氣喘是一種很常見的過敏性疾病,其病因是具有過敏体質的患者,對環境中原本對大部份人無害的物質產生免疫反應,使一些介質釋放出來,引起氣管收縮造成咳嗽,甚至呼吸困難、哮鳴,形成氣喘,若發作時不能妥善照顧,則有危及生命之虞 。

二.過敏原種類

近年來在台灣隨著工業化的發達,有愈來愈多的人罹患過敏疾病。能引起過敏反應的物質成份通常為蛋白質,現今所研究的過敏原主要以蛋白質為主,在已知生物活性的過敏原中,約有一半的比例具有酵素的活性,而酵素類過敏原之溶解度、濃度及在細胞中存在的位置都可能增加其致敏性。例如,蛋白質水解酵素即可能破壞細胞的表皮層(epithelial surface layers),以利過敏原進入體內而引起免疫反應。

1.依來源分類

(a)動物類過敏原

常見的氣喘激發物有溫血寵物的皮屑、毛髮、羽毛(如:貓、狗、鳥、老鼠…等)、家塵(主要內含mite)、蟑螂等;在蛋中發現ovalbumin、lysozyme、ovomucoid及conalbumin曾被報導為過敏原。蟑螂中的過敏原有aspartic protease、calycin、glutathione transferase及troponin。而塵瞞中的cysteine protease、lysozyme、trypsin、chymotrypsin、amylase等都被報導為過敏原。海鮮食物方面有蝦子的tropomyosin、serum albumin也是主要的過敏原種類。

(b)植物及非動物類過敏原

植物的花粉為外國常見的季節性過敏原,現已知其中的profilin、Ca2+-binding protein、ribonuclease、cytochrome C、trypsin inhibitor等為過敏原。橡膠中的rubber elongation factor會使常戴橡膠手套的醫護人員或脊柱裂病患(spina bifida patients)產生過敏的症狀。於食品中的麵粉有α-amylase trypsin inhibitor等過敏原;此外花生(peanut)、堅果等種子儲存性食物中cotyledon、vicilin family proteins等。在黴菌方面,restrictocin mitogillin、α-amylase、ribonuclease、alcohol-dehydrogenase、exo-1,3-beta-glucanase 、ribosomal P2 protein及cyclophilin都被報導為過敏原。

2依作用方式分類

(a)吸入性:如花粉、塵瞞、黴菌、舊棉絮、草蓆、蟑螂、動物毛屑及唾液等。

(b)食物性:藥物、食物,特別是魚、蛋、牛奶、水果及海鮮等。

(c)接觸性:毛髮、染料、化妝品、毒常春藤、錢幣中的鎳、手套中的乳膠等。

(d)注入性:昆蟲的毒液(如蜜蜂及藥物)。

3台灣常見的過敏原

台灣屬於海島型氣候,地處亞熱帶,終年溼度高。從研究中發現,在台灣,最重要的過敏原是家塵(93.4%)(病人皮膚試驗呈陽性)、塵瞞(90.2%)、舊棉絮(37.5%)、黴菌(37%)、蟑螂(45%)、草蓆(31.2%);近年來,空氣污染中的一些成分也被懷疑是過敏原。其中黴菌所產生的孢子,它是微小到在顯微鏡下才看得到的,它常長在麵包、奶油或變壞的水果;尤其在黑暗潮濕的房間或地下室中黴菌對於引起過敏是相當重要的。在戶外,黴菌大量生長在穀物、草類、灌木樹的枝葉和土壤等;台灣因地處亞熱帶,氣溫高、濕氣重、黴菌從三、四月開始到十二月之間大量繁殖,尤其是在夏天,黴菌是台灣最重要的過敏原。

三.研究動機與目的

針對台灣過敏病人做的研究分析發現最重要的過敏原為家塵、塵瞞、蟑螂及黴菌等等,花粉和食物較少有關係,而且年齡愈大,黴菌變得愈重要;黴菌種類繁多,空氣中不僅有許多不同屬的黴菌存在,同一屬中又有許多不同種的黴菌,且其有特殊的生活週期,這些因素增加了黴菌過敏原研究的複雜性。在自然環境中,人類可接觸超過一百種不同的黴菌,且空氣中黴菌孢子的數目更被發現可超越花粉計數的一千倍。

台灣潮濕溫熱,呼吸道方面的過敏性疾病已有日益嚴重的趨勢。而在台灣地區的調查中最常見的黴菌為Cladosporium、Penicillium、Aspergillus、yeast等四屬,室內較常見的黴菌則為Aspergillus及Penicillium,其中青黴菌屬(Penicillium)已有研究報告指出為引發氣喘之誘因。

在黴菌中青黴菌屬中之P. citrinum(橘青黴)這一個species被認為是大台北地區最常見的菌種之一;在篩選的910株青黴菌當中,有 40.5%為P. citrinum。而在67個檢測的過敏性支氣管氣喘患者中,有16個病人(24 %)的人會對青黴菌屬產生過敏;而這16人當中就有15個病人會對P. citrinum產生過敏反應。

目前臨床用來診斷甚至治療黴菌過敏病的,均為各黴菌的粗萃取物,其中含有多種複雜成份。許多因素如培養黴菌所用的培養基組成、培養時間及溫度等,均會影響到所製備的黴菌粗萃取物中過敏原含量的多寡。因此鑑定與純化各種不同的黴菌過敏原,探討其特性,皆有其重要性。本實驗室目前致力於青黴菌屬(Penicillium sp.)過敏原的研究,在青黴菌屬中發現許多具有與IgE結合能力的蛋白質,其中利用一單株抗體P40鑑定出點青黴(Penicillium notatum)中已知C端約100個氨基酸序列,分子量為68kDa的過敏原Pen n20,在19位過敏性氣喘病人及20位供血者中有56%的血清會辨識這個蛋白質,故為點青黴中重要的過敏原之一。經序列的比對發現其應屬於N-乙醯胺葡糖水解酵素(N-acetylglucosaminidase)家族中的一員,又青黴菌屬中之橘青黴亦為台北地區重要的過敏來源之一,且pen c20尚未被鑑定出來。故本實驗為鑑定橘青黴的粗萃取物中引起過敏病人反應的66kDa過敏原蛋白質Pen c20,並利用分子選殖技術將過敏原基因選殖出來,將其大量表現成為重組過敏原,期能作為診斷的標準物或用於免疫療法上。

 

貳.結果

一.青黴過敏原Pen c 20的鑑定

 為了鑑定點青黴的過敏原,利用SDS-PAGE將其菌絲的蛋白質展開並跟過敏病人血清進行免疫轉漬,我們在66kDa左右發現一具有IgE結合能力的蛋白質。於是透過網路資料庫搜尋有關青黴菌屬過敏原蛋白質的相關資料,發現Shen 等人指出,在點青黴中有一已知C端約100個氨基酸序列之68kDa過敏原,命名為Pen n 20,且有一單株抗體P40會辨認之。於是在取得單株抗體P40後,想對點青黴之66kDa過敏原做進一步的了解,於是將點青黴粗萃取蛋白質以雙向電泳展開,並以辨識點青黴(P. notatum)過敏原Pen n 20的單株抗體P40進行免疫轉漬分析,發現確有一分子量為66kDa的過敏原蛋白質被單株抗體所辨識。藉由雙向電泳標定蛋白質的比對,這個蛋白質的分子量及等電點,分別為66kDa,pI 5.0。此外,藉由已知C端約100個氨基酸序列於國家生物技術資訊中心(The National Center for Biotechnology Information , NCBI) 以程式BLASTP 2.0.8,進行資料庫SWISSPORT的比對與搜尋,發現其可能為 N-乙醯胺基葡糖水解酵素(N-acetylglucosaminidase)家族中的一員,在青黴菌屬(Penicillium)和黃麴菌屬(Aspergillus)中約有70%的相似度。

因為由點青黴粗萃取物之雙向電泳中所得到之P40所辨認之蛋白質的量很少,故我們試著改變培養基環境來增加Pen n 20的表現量,而Lortio M.等人指出,若在培養基中添加此酵素之受質,如N-乙醯胺基葡萄糖(N-acetylglucosamine),一些真菌或黴菌中的N-乙醯胺基葡糖水解酵素會被誘導出來。於是我們利用修飾過的Richard’s medium來培養點青黴。結果在培養基中發現有一66kDa的蛋白質被誘導出,經由免疫轉漬法證明其的確會被P40所辨識。

又青黴菌屬中之橘青黴亦為台北地區重要的過敏來源之一,且Pen c 20亦尚未被鑑定出來。故為鑑定橘青黴的粗萃取物中引起過敏病人反應的66kDa過敏原蛋白質Pen c 20,將橘青黴粗萃取蛋白質以雙向電泳展開,並與過敏病人的血清進行免疫轉印分析,發現亦有一個分子量及等電點為66kDa, pI 5.0的蛋白質具有與IgE結合的能力。於是利用先前資料庫SWISSPORT 的搜尋,在比對青黴菌屬(Penicillium)和黃麴菌屬(Aspergillus)之N-乙醯胺基葡糖水解酵素中較為保留的區域後,設計了五個引子以進行Pen c 20基因的選殖。

二.青黴菌過敏原Pen c 20的選殖0

1.全RNA的抽取、mRNA的純化及cDNA的合成

整個構築cDNA的過程採用marathon kit。首先先決定抽取RNA的時機,RNA的時機需為過敏原RNA含量高的時候。將點青黴的孢子溶液移植至tryptic soy broth中培養24~48小時,將培養液濾去以TRIzol-reagent方法抽取RNA,以電泳分析所抽取的全RNA確定沒問題後,可進一步利用oligo-dT親合力管柱層析法由全RNA純化出mRNA。接著利用MarathonTM cDNA amplification kit 由mRNA製造出cDNA。最後於cDNA的兩端接上adaptors,以利5’端與3’端RACE的進行,至此即完成cDNA library的構築。

(a)內部核酸序列分析

於選殖所用的引子是由之前藉由比對的結果找出N-乙醯胺基葡糖水解酵素中段保守的區域設計五個5’端的引子P1、P2、P3、P4 及P5,根據已知Pen n 20 的3’端核酸序列設計一3’端的引子:P6

先以P5及P6進行PCR反應,結果可見有約240 bp的產物。由定序的結果所推出的胺基酸序列與已知Pen n 20之3’端核酸序約有90%的相似度,故可確定所選殖出來的DNA片段是屬於橘青黴66kDa過敏原Pen c 20的基因。

接下來就已知的Pen c 20序列設計專一性的3’端的引子P7,用引子為P4及P7,,得到約550 bp的產物,再根據得知的序列設計專一性的3’端的引子:P8,以引子P3及P8進行PCR反應,得到約600 bp的產物,再根據得知的序列設計專一性的3’端的引子:P9,以引子P1及P9進行PCR反應,得到約800 bp的產物,最後得到約1700 bp之內部序列。

(b)3’端核酸定序分析

由內部序列設計3’端RACE的引子,其5’端的引子是依據上述內部序列所設計,而3’端的引子則是利用adaptor上面的序列所設計,首先進行第一次PCR 反應,所用引子為P5及P10,接著再以第一次PCR產物作模板進行第二次PCR反應在,引子則是利用P5及P11,經由兩次PCR反應得到一段約400 bp的產物,經定序可得到3’端的序列。

(c)成熟蛋白質之cDNA序列

由於在這段期間資料庫中Diez B.等人已將點青黴之N-乙醯胺基葡糖水解酵素(Pen n 20)完整cDNA選殖出來[32],根據其資料顯示引子P1所在位置即為推測signal peptide之切割位置,前尚有18個氨基酸之signal peptide。推測親緣關係極為相近的橘青黴之過敏原Pen c 20很可能也有類似序列結構,故綜合內部序列及3’端RACE重疊排列可得到此成熟橘青黴過敏原蛋白質Pen c 20的cDNA序列,共有1749個核甘酸,共含582個胺基酸,其所推出胺基酸序列在上方,命名為Pen c 20。其具有六段可能為N-link醣化的序列(N-X-S/T),分別位於:Asn29-Ile30-Thr31-Trp32,Asn318-Lys319-Thr320-Tyr321,Asn353-Phe354-Ser355-Lys356, Asn428-Leu429-Thr430-Ala431,Asn500 -Leu 501 -Thr 502 -Thr 503及 Asn 595 -Gln 596 -Thr 597-Ala598。cDNA序列除了讓我們對蛋白質序列有所了解外,另外可將此cDNA序列送入表現系統中(expression system),得到大量並高純度的重組過敏原。

三.青黴菌過敏原Pen c 20的表現

將此過敏原表現在細菌系統中,期望能得到大量而純度高的過敏原以供應用。利用QIA express system,採用pQE-30質体,在重組過敏原的N端具有六個histidine residues,可以與Ni-NTA resin結合,可只利用一根親和力管柱即可達到純化目的。

1.重組過敏原表現質体的建構

成熟過敏原的表現以cDNA作模板,兩端的引子為成熟過敏原的兩端序列,其N端加KpnⅠ,C端加HindⅢ切割序列,於annealing溫度50℃下,進行PCR反應後,以電泳回收PCR產物並接入pGEM-T Easy質体中,經轉形、篩選、序列鑑定,加入20% glycerol作JM109菌種保存。從含過敏基因的JM109菌種培養液中,抽取含過敏原基因的pGEM-T Easy質体,以KpnⅠ及HindⅢ於37℃作用4小時雙重切割切出過敏原核酸序列。pQE30質体也同時以KpnⅠ及HindⅢ於37℃作用4小時雙重切割切出線性。然後將過敏原核酸序列與線性pQE30質体於16℃下接合16小時,接合產物再轉形至大腸桿菌內,在含有ampicillin(50mg/ml)及kanamycin(25mg/ml)的LB plate培養基上培養至長出許多白色的菌落,挑選15個於含ampicillin及kanamycin的LB培養液中培養,之後以菌液作模板,pQE30質体上的pQE-F、pQE-R序列作為引子,進行PCR反應。其中有6個菌落的產物為1900bp左右,再將其以專一的引子進行PCR反應作雙重確認。此含有過敏原基因的M15菌株即可用於大量表現。

2.小量培養

將含過敏原基因的M15[Prep4]100微升隔夜菌液移至6毫升含ampicillin及kanamycin的LB培養液於37℃下培養3小時至O.D.600約為0.7後,加入IPTG至2mM誘導表現,每隔1小時,收菌液1毫升,共誘導4小時後,以5000rpm離心5分鐘,上清液以TCA將蛋白質沉澱下來,即為medium蛋白質。pellet的部份為菌体以0.25毫升binding buffer (20 mM Tris-HCl pH7.9, 500 mM NaCl,5 mM imidazole)打散,並加入lysozyme (1 mg/ml)於冰上反應30分鐘後,利用超音波破膜機(sonicator)震盪打碎菌体。以13000rpm離心10分鐘後,上清液一樣以TCA將蛋白質沉澱下來,即為細胞質蛋白質。pellet為不溶的部分,包括了包含体(inclusion body)。利用SDS-PAGE分析medium蛋白質、細胞質蛋白質、不溶的部分(包含体),發現被誘導的重組過敏原大部份表現在包含体中,且在誘導2~3小時後達最大量。

3.大量培養

將含過敏原基因的M15[Prep4]20毫升隔夜菌液移至250毫升含ampicillin及kanamycin的LB培養液於37℃下培養3小時至O.D.600約為0.7後,加入IPTG至2mM誘導表現2.5小時後,以JA14、5000rpm、4℃離心5分鐘,丟棄上清液,pellet的部分為菌体,以25毫升binding buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.9, 500 mM NaCl,5 mM imidazole)打散,並加入lysozyme (1 mg/ml)於冰上反應30分鐘後,利用超音波破膜機(sonicator)震盪打碎菌体。以JA20、13000rpm、4℃離心15分鐘後,保存pellet部分。

4.重組過敏原的純化

所有純化所用到的緩衝液都含有8M urea。將inclusion body回溶於含25毫升8M urea的binding buffer中,並與製備好的resin於室溫下作用1小時,以離心的方式移除不會與Ni2+結合的部分後,填充回管柱中,在denature的狀態下以含imidazole梯度的緩衝液沖提。先以含10 mM imidazole的緩衝液沖去非親和力結合的雜蛋白質,再以含20 mM、50 mM、100 mM、150 mM、200 mM imidazole的緩衝液沖提,每1.5ml為一收集單位,以O.D.280監測蛋白質含量,並取5微升以SDS-PAGE分析,重組過敏原主要出現在100 mM imidazole沖提時的三個fraction,而得到純的重組過敏原。

5.重組過敏原的抗体結合能力

經過2.5小時的IPTG誘導下,過敏原在大腸桿菌中以包含体大量產生,將其利用Ni2+親和力管柱純化出來,進行實驗分析。在IgE結合能力方面,將所純化到的橘青黴重組過敏原利用免疫轉印法來確認。將純化的重組過敏原利用10% SDS-PAGE展開,並轉印至PVDF纖維膜上,再以過敏病人的血清進行辨認,結果重組過敏原蛋白質也具有與IgE結合的能力。

 

參.討論

一.黴菌與過敏

台灣屬於海島型氣候,又因地處亞熱帶,故氣溫高而濕氣重,塵瞞與黴菌被認為是引起過敏性氣喘主要的過敏原來源。黴菌從三、四月開始,到十二月之間大量繁殖,尤其是在夏天,是台灣最重要的過敏原之一。1970年代以來,全世界許多報告都指出過敏疾病包括氣喘、過敏性鼻炎和異位性皮膚炎的罹患率持續在增加,病情愈趨嚴重,而台灣地區也不例外。過去二十年間,台北市學童氣喘病發生率在1974年為1.30%,然後快速增加,1985年為5.08%,1991年為5.80%,到1994年增加為10.79%,約增加了八倍[33],過敏性鼻炎、異位性濕疹和蕁麻疹也有類似趨勢;因此,實在有必要投入更多的研究,了解過敏疾病的成因,進而發展新的預防與治療之道。

室內常見的黴菌有青徽菌屬及黃麴菌屬等[34],其中青黴菌屬就有超過一百五十種不同的種類,而目前診斷過敏的試劑中,青黴菌屬是以點青黴的粗萃取物作為測試之用,因此我們針對點青黴及和其親緣關係極近的橘青黴作過敏原的鑑定與研究。

二.青黴菌屬過敏原

利用雙向電泳和免疫轉印法,鑑定出青黴菌屬66kDa之過敏原,在過去的研究顯示在19位過敏性氣喘病人中有超過42%的病人會辨識此66kDa的過敏原[28],故其為一重要過敏原。Pen n 20 的cDNA序列從Met開始的18個胺基酸為signal peptide,故Pen n 20應屬於分泌型蛋白質;由點青黴菌絲粗萃取物之雙向電泳中所得到知Pen n 20的量很少,由過去的經驗得知,不同的培養方法所培養出之菌絲中所含的蛋白種類及數量皆有所不同,故我們試著改變培養條件來增加Pen n 20的表現量,而曾有報導指出[35-37],若在培養基中添加此酵素之受質,如N-乙醯胺基葡萄糖(N-acetylglucosamine),會誘導一些真菌或黴菌中的N-乙醯胺基葡糖水解酵素的表現。於是我們利用修飾過的Richard’s medium[30,38,39]來培養點青黴,結果在培養基中發現有一66kDa的蛋白質被誘導分泌出來,經由單株抗體P40進行免疫轉漬法證明其的確是Pen n 20。而本實驗鑑定出橘青黴過敏原Pen c 20,選殖出的cDNA序列所推衍出的胺基酸序列與Pen n 20的序列約有71%的相同度,推論Pen c 20應與Pen n 20一樣同屬於N-乙醯胺基葡糖水解酵素(N-acetykglucosaminidase),且很可能也為一分泌型蛋白質。對過敏病人來說,黴菌的分泌型蛋白質可能因為容易接觸到呼吸道,故較可能成為過敏原。

由SDS-PAGE分析所得到成熟的Pen n 20分子量為66kDa且PI約等於5,由電腦計算其胺基酸序列所得分子量為66.5kDa,PI=5.1,兩者大致上是相符的,推測並無太複雜的後修飾作用。但Shen等人指出[40],在點青黴中,P40所辨認之過敏原蛋白質分子量為68kDa,這可能是因為在不同的培養環境下,相同菌種所進行的轉譯後修飾作用可能有所差異而造成的。成熟的過敏原Pen c 20序列具有六段可能為醣化的序列,分別位於Asn29-Ile30-Thr31-Trp32,Asn353-Phe354-Ser355-Lys356, Asn428-Leu429-Thr430-Ala431,Asn500-Leu501-Thr502-Thr503及Asn595-Gln596-Thr597-Ala598;而Pen n20則有四段,分別是:Asn29-Ile30-Thr31-Trp32 ,Asn348-Tyr349-Ser350-Thr351,Asn496-Leu497-Thr498-Ser499 ,Asn591-Gln592-Thr593-Val594其中有四個位置落在相似的區域,故這兩個蛋白質Pen c 20和Pen n 20可能具一樣醣化修飾。

點青黴和橘青黴的親緣關係非常相近,以後可用於診斷或免疫療法上,同屬的黴菌只要用一種即可,當然這些仍需要更多的研究去証實其它過敏原也有此現象。

三.過敏原之生物功能

由序列比對發現橘青黴過敏原Pen c 20為一N-乙醯胺基葡糖水解酵素;本實驗室之前從青黴菌屬中已鑑定出Pen c 1、Pen n 1與Pen c 2,前兩者為鹼性絲胺酸水解酵素,而後者為液胞絲胺酸水解酵素。煙色麴菌中亦鑑定出一屬於鹼性絲胺酸水解酵素的重要過敏原,其它還有在塵瞞中發現的Der p 1、Der f 1及Eur m 1屬於cysteine protease,Der p 3、Der f 3及Der p 9屬於serine protease;在蟑螂中發現的Bla g 2屬於aspartic protease。塵瞞的Der p 4為amylase;塵瞞的Der p 8和蟑螂的Bla g 5為glutathione-S-transferase;煙色麴菌的Asp f 1為mitogilin ribotoxin,而HSP(heat shock protein)90亦為其過敏原;Cladosporium nerbarum和Alternaria alternata中的ribosomal P2 protein、aldehyde dehydrogenase(ALDH)以及YCP4蛋白等,均被証實為過敏原;而在Candida albicans 中的alcohol dehydrogenase也是一過敏原。此外,有許多過敏原的生物功能目前還不知道。

過敏原的生物活性與其致敏性之間的關連,雖尚未釐清,但目前認為有一種可能性,就是過敏原的生物活性可能可以促進過敏疾病的免疫反應發生;如Der p 1其為cyteine protease,在体外實驗中已証實Der p 1可切割CD23及CD25,進而影響免疫反應,另外其也會影響表皮細胞的可穿透性,且會誘導細胞激素的產生。而煙色麴菌培養液中的蛋白質水解酵素會引起表皮細胞的剝離,也會誘導一些前發炎反應細胞激素的產生,促進發炎反應。至於我們所鑑定出青黴菌屬中的N-乙醯胺基葡糖水解酵素是如何造成免疫反應,則需更進一步研究探討。

四.分析過敏原特性的重要性

目前用於診斷治療上的通常為過敏物的粗萃取物,其包含許多成份,雖然大部分所要檢測的過敏原皆在其中,但是仍然無法排除其它不純物質所引發的非專一性免疫反應,所以在診斷時,只能概括的說這個人對青黴菌過敏或對其它過敏原如塵瞞過敏。再者,每次的粗萃取物,可能因為培養環境、溫度或是萃取方法上的差異而導致粗萃取物當中的成份或多或少有量上面的差別,如果又遇到過敏原有酵素活性如蛋白質水解酵素,則可能會在保存的過程中分解掉,這些情況對於過敏疾病這種必須將過敏原標準化的需求,實在不太好;在診斷上面,其會導致檢測值的變異;若用於免疫療法上,則可能因伴隨在萃取物中不純的物質而引發一些不必要的免疫副作用。如今隨著愈來愈多的研究,許多過敏原一一被鑑定出來,加上基因工程的發展,利用大腸桿菌大量表現重組過敏原蛋白質,更加速了過敏原的特性分析。重組過敏原蛋白質可改善原先粗萃取物中含不純物質的問題,減少了不必要的免疫副作用,且診斷上可更為精準,故利用重組過敏原蛋白質,來進行免疫治療或是其特性研究,都有日益增加的趨勢。

現今在治療過敏性疾病或是進行研究時,有用整個過敏原,或是將過敏原改變如特定胺基酸之突變,也有利用抗原決定點胜太片段,更有將過敏原的基因做成DNA疫苗,來達到治療的效果。利用整個過敏原蛋白質可以建立動物模型,以了解過敏原所引起的致敏機轉,或是用於減敏治療上面。已有實驗証明當實驗動物暴露在噴霧狀的ovalbumin這個過敏原時,會產生暫時性的IgE反應,但其會隨著時間而減少,最終即使暴露在過敏原之下也不會產生IgE。根據研究,目前認為長期接受豕草、牧草、杉木和樺木等花粉抽取液的注射治療對季節性的過敏症非常有效。而對家塵、塵瞞及動物皮毛垢屑等過敏原的效果也很好。不過這種減敏性治療現在大多是利用粗萃取物來進行,而這可能會因為粗萃取物中其它不純的成份而引發過敏;對於治療青黴菌過敏病人,將來可利用純化後的重組過敏原rPen c 20來進行減敏治療,可能可以達到良好的效果,並且不致於有不必要的免疫副作用,但仍必須進行其他的試驗,才可以直接應用於人体上。

在對樺木花粉過敏原Bet v 1的研究發現,利用點突變技術,將抗原上可能與IgE結合的位置之胺基酸加以突變,但其仍保有T細胞的抗原決定點,結果此突變後的抗原可使T細胞株活化,而在抑制試驗及免疫轉印實驗中,卻顯示突變後的抗原大大減低其與IgE結合的能力,此外在皮膚測試時反應強度也比原來野生型的Bet v 1來得低;因此,不只是利用整個重組過敏原蛋白質,若能配合由抗原決定點分析中所得到的資訊,對於會和IgE結合的胺基酸進行突變,可能也可以有效減低IgE與其結合能力而達到療效。

DNA vaccines被發現可以引起對過敏原專一性的Th1初級反應(primary response),當再次受到過敏原刺激時,仍可以抑制Th2反應;此外,如果原來是偏向Th2反應,在將過敏原DNA送到實驗動物体內後,結果顯示雖然所產生Th2型細胞激素IL-4量沒有明顯的變化,但是Th1型細胞激素IFN-g卻是明顯增加,使得動物体內IgE與IgG1沒有急遽昇高,這與之前的研究報告指出IFN-g可抑制B細胞產生IgE相符合,相反的在動物体內IgG2這個與Th1相關的抗体量增加了。在1996年Hsu等人將含有塵瞞過敏原基因的表現質体以肌肉注射到老鼠体中,結果發現其可長期表現,並且可以防止因吸入性過敏原所引起IgE的產生。在1999年Roy等人將花生過敏原Ara h 1的DNA經由多醣類chitosan包裝送入實驗動物的腸道中,發現的確使其對Ara h 1的免疫反應偏轉向Th1反應。本實驗將橘青黴的過敏原Pen c 20的cDNA選殖出來,故將來也許可以將其設計成DNA vaccine以治療對青黴菌屬過敏的病人。

五.未來展望

本實驗從橘青黴菌中鑑定出一過敏原Pen c 20,並將其利用大腸桿菌表現出來,且由Pen c 20 cDNA序列發現與點青黴的Pen n 20過敏原相同度相當高,顯示點青黴和橘青黴的親緣關係非常相近,故未來在臨床方面希望可將此重組過敏原蛋白質應用於診斷青黴菌過敏病人,並收集更多對青黴菌過敏病人的血清,統計此過敏原的發生率,以評估此重組過敏原蛋白質是否對青黴菌過敏病人在減敏治療方面有所助益。

 

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